La sinagoga de Samuel ha Leví, fue mandada erigir entre los años 1336 y 1357 por este importante personaje, que ocupó en la corte del rey Pedro I de Castilla diversas funciones como Oidor de las Audiencia y Tesorero Real.
Las diversas vicisitudes la judería toledana, incluida la destrucción de parte del barrio judío en 1391, no afectaron a la sinagoga que no debió sufrir daños de importancia.
Con la expulsión de los judíos en 1492 los Reyes Católicos otorgaron a la Orden de Calatrava la "sinagoga mayor que los judíos tenían en Toledo, a cambio del Alcázar y Palacios de Galiana con su iglesia de Santa Fe, posesiones de esta orden".
En 1494 el edificio pasó a formar parte del Priorato de San Benito, sirviendo de hospital y asilo para los caballeros calatravos la zona que ocupaba la escuela rabínica y la galería de mujeres. La antigua gran sala de oración pasa a ser templo cristiano y lugar de enterramiento de algunos caballeros, apareciendo en la documentación como Iglesia de San Benito.
Durante el siglo XVI, deja de ser hospital y asilo para convertirse exclusivamente en iglesia, construyéndose una puerta de entrada a la sacristía "con los primores platerescos de la época" así como un arco empotrado utilizado para dar culto a una imagen de la Virgen. Se adosa un retablo a cuerpo central del antiguo hejal y se coloca el altar principal sobre el primitivo suelo de la sinagoga. La antigua sala de mujeres se tapió y pasó a ser utilizada como vivienda y se colocó un entarimado de madera para el coro en el lado Oeste.
En el siglo XVII la iglesia de San Benito pasa a ser conocida vulgarmente como del Tránsito por un cuadro del Tránsito de Nª Sª, que ornó el altar plateresco desde entonces. En este momento se construye adosado al muro Norte el Archivo de las Ordenes Militares de Calatrava y Alcántara en el que hoy se ubican las salas I, II, y III del Museo Sefardí.
En el siglo XVIII la decadencia del poderío de las Ordenes Militares afecta también a la antes rica iglesia de Nª Sª del Tránsito que ahora aparece en la documentación simplemente como ermita. En las guerras napoleónicas fue utilizada como barracón militar, sufriendo un continuo deterioro a lo largo de casi todo el siglo XIX continuando su uso como ermita hasta los procesos desamortizadores de Mendizábal. El 1 de mayo de 1877 fue declarada Monumento Nacional. Desde entonces y hasta 1910 se llevaron a cabo una serie de restauraciones para paliar el mal estado del edificio. En 1910 se confía la antigua sinagoga al Patronato del Museo del Greco regido por el Marqués de la Vega-Inclán que procede a su restauración según los criterios de la época. De 1910 hasta 1968 la sinagoga estuvo bajo la protección y custodia de las Fundaciones de la Vega-Inclán, realizándose en los años 60 la última restauración que hace desaparecer la antigua sillería coral colocada en la época del marqués así como las lápidas de los caballeros calatravos, reparando yeserías, solados, carpintería y añade a las paredes la actual tapicería en seda, donada por la familia Pinto-Coriat.
Desde 1970 hasta la actualidad el edificio y el Museo Sefardí en él ubicado y creado en 1964 pasan a ser directamente gestionados por el Estado Español, pasando el Museo Nacional de Arte Hispano-Judío, a formar parte de la red de Museos Estatales del Ministerio de Educación y Cultura.